С собой царь взял казну, личную библиотеку, иконы и символы власти. Посетив село Коломенское, он не стал возвращаться в Москву и, проскитавшись несколько недель, остановился в Александровской слободе. 3 января 1565 года он объявил о своем отречении от престола, по причине «гнева» на бояр, церковных, воеводских и приказных людей. Через два дня в Александровскую слободу прибыла депутация во главе с архиепископом Пименом, которая уговорила царя вернуться на царство.

Когда в начале февраля 1565 года он вернулся в Москву, то объявил, что вновь принимает на себя правление, с тем, чтобы ему вольно было казнить изменников, налагать на них опалу, лишать имущества без докуки и печалований со стороны духовенства, и учредил 3 февраля «опричнину».
ъ В опричнину царь отделил часть бояр, служилых и приказных людей и вообще весь свой «обиход» сделал особым: во дворцах Сытном, Кормовом и Хлебенном был назначен особый штат ключников, поваров, псарей и т.п.; были набраны особые отряды стрельцов.

На содержание опричнины были назначены около 20 городов (в том числе Москва, Вологда, Вязьма, Суздаль, Козельск, Великий Устюг) с волостями. В самой Москве некоторые улицы были отданы в распоряжение опричнины (Чертольская, Арбат, часть Никитской и прочие); прежние жители были переселены на другие улицы.

В опричнину было набрано также до 1000 князей, дворян, как московских, так и городских. Им были розданы поместья в волостях, назначенных на содержание опричнины; прежние помещики и вотчинники были переведены из тех волостей в другие.

Главная цель опричнины — уничтожить остатки феодальной раздробленности, подорвать основы боярско-княжеской независимости — не была достигнута. Общий результат опричнины историк XIX столетия В. О. Ключевский формулирует так: «Современники поняли, что опричнина, выводя крамолу, вводила анархию, оберегая государя, колебала самые основы государства. Направленная против воображаемой крамолы, она подготовляла действительную». В результате этого:
На западе войска Речи Посполитой успешно оттеснили русских. Ливонская война была окончена с незначительными достижениями русских;
Шведские войска захватили Нарву, Копорье и др. уезды и отказывались их возвращать;
В 1571 г. из-за низкой боеспособности опричного войска крымские татары сожгли Москву;
Произошло дальнейшее закрепощение крестьянства, причём в самых жёстких формах (барщина).

В 1572 году опричнина фактически прекратила своё существование – войско показало свою неспособность отразить нападение крымских татар на Москву, после чего царь принял решение ее отменить.
Жертвами репрессий за время опричнины стало, по результатам анализа поминальных списков, около 4,5 тысяч человек, однако многие историки считают эту цифру заниженной.