В области медицины, которая занимается состоянием системы свертывания крови человека или системой гемостаза, всем комплексом систем, занимающихся остановкой кровотечения, сейчас наблюдается огромная неудовлетворенность состоянием дел, в первую очередь диагностикой. Врачи всего мира прямо говорят, что нынешние методы исследования состояния свертывания крови крайне неудовлетворительны. У человека при заборе кровь может свернуться прямо в игле шприца, но при этом диагностические тесты покажут, что у него все в порядке. У человека может быть тяжелейшее кровотечение, а диагностические тесты могут этого не уловить.

В конце 80-х годов картина работы системы гемостаза более или менее сложилась, и стало понятно, что существующие тесты работают крайне плохо. С одной стороны, люди попытались это обойти путем усложнения тестов, то есть постепенно они дополнялись какими-то модификациями, вариантами, тестами другого типа, пока не появилось то, что сейчас называется коагулограммой — более или менее устоявшийся набор из нескольких десятков тестов, который позволит очень опытному врачу дать представление о том, как работает система гемостаза. К сожалению, есть вещи, которые коагулограмма в принципе не видит и не может увидеть, например склонность к повышенному тромбообразованию. Риск тромбозов, который является одной из смертельных опасностей для человека, коагулограмма практически не видит.

 

Наша команда, работавшая под руководством Фазли Атауллаханова, сосредоточилась на одном из этих аспектов. Дело в том, что процесс гемостаза — процесс принципиально пространственный. Если у вас есть ранение, то вам нужно сделать «заглушку» в месте повреждения, ни в коем случае не дальше. Если вы сделаете это дальше, то нарушите кровоснабжение каких-то органов. Это нельзя имитировать в пробирке, где идет полное перемешивание, вам нужна пространственно-неоднородная система. Была разработана — сначала для фундаментальных исследований, а потом для прикладных — такая система, в которой активация процесса свертывания происходила локально нанопокрытием с тканевым фактором. Оттуда процесс свертывания распространялся в плазме крови в пространстве. После нескольких лет поиска людей, которые смогли бы поддержать эту систему, нам удалось получить поддержку от «Роснано» и основать компанию «ГемаКор», которая занялась коммерциализацией этой системы. Сейчас этот тест уже доступен в ведущих гематологических и сердечно-сосудистых клиниках России под названием «Тромбодинамика».

Михаил Пантелеев

доктор физико-математических наук, профессор кафедры медицинской физики физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующий лабораторией клеточного гемостаза и тромбоза ФНКЦ ДГОИ им. Д. Рогачева

Система гемостаза

Биофизик Михаил Пантелеев об уровне смертности от кровотечений, роли тромбоцитов в организме и системе свертывания крови

Если говорить о разных системах человеческого организма, то система гемостаза, которая занимается вопросами остановки кровотечения при ранениях, кровоизлияниях и прочих типах нарушения целостности сосудистой системы, является самой проблемной в нашем организме. У людей могут быть самые различные заболевания, но умирают они чаще всего от нарушений гемостаза.

Наш организм имеет несколько уровней защиты против кровотечений и кровоизлияний. Один уровень — это сосудистый гемостаз. Сокращение мышц в определенных ситуациях способно привести к сужению сосудов (вазоконстрикции) и замедлению или даже прекращению какого-то слабого кровотечения. Следующий слой — тромбоцитарный гемостаз. В нашей крови присутствуют специальные клетки — тромбоциты, которые в случае повреждения слепляются и затыкают место повреждения. Тромбоцитов немного, их примерно в 10 раз меньше, чем эритроцитов, и по размеру (если считать на объем) они на порядок-другой меньше. Поэтому внешне кажется, что тромбоцитов не очень много. Тем не менее они жизненно важны для остановки кровотечений. Третий уровень — система свертывания крови — хитрый каскад реакций в плазме крови, который завершается тем, что специализированный белок фибрин начинает полимеризоваться и делать трехмерную сетку. Такая трехмерная сетка на микроуровне может удержать внутри себя количество воды, которое раз в тысячу превосходит ее по массе.

С учетом того, как сложно устроена система гемостаза, в каком-то смысле не удивительно, что у нас есть проблемы и с диагностикой ее нарушений, и с адекватной их терапией. То, что люди делали на протяжении XX века, в огромной степени было результатом эмпирического подбора методов терапии или изобретения методов диагностики.

«Мы до сих пор не знаем, как образуются тромбы»

Биофизик Михаил Пантелеев о системе свертывания крови, компании «ГемаКор» и инновационном методе диагностики гемостаза

О системе гемостаза

У нас несколько главных интересов. Первое направление, которое мы ведем совместно с Фазли Атауллахановым и еще с несколькими командами по миру, — это динамика сложных систем. Данное направление посвящено исследованию устройства биологических систем в целом и их регуляции. Система гемостаза здесь является великолепным стартовым материалом, потому что если посмотреть на нее с точки зрения биохимика, то она является гиперсложной.

Например, само по себе свертывание крови, процесс, обеспечивающий локальное желирование крови в месте повреждения, представляет собой каскад, в который входит 60–70 белков и 200–300 реакций, среди которых есть одна осмысленная, или одна легко понятная — как раз та, которая обеспечивает желирование, а остальные реакции — регуляторные, которые обеспечивают управление этим процессом.

И если мы не будем понимать, как этот процесс управляется во времени и пространстве, то мы оказываемся в положении дикаря с топором перед ноутбуком. Мы можем его сломать, можем ударить по кнопкам так, чтобы он что-то выдал, но нормально управлять не можем.

Тромбоцитарный гемостаз — вторая часть процесса остановки кровотечения, связанная с агрегацией специальных клеток-тромбоцитов, — представляет собой еще более сложную систему, потому что тромбоцит — это полноценная клетка, у него уже тысячи белков, и процессы сигнализации внутри тромбоцита, которые запускаются десятком разных рецепторов, взаимодействуют друг с другом и выдают несколько разных ответов, по которым тромбоцит принимает решение, прикрепляться ему или не прикрепляться, переходить в один вариант или в другой. Это сложнейшая задача с точки зрения управления, и экспериментально ее тоже намного сложнее исследовать.

О формировании тромбов

Среди результатов, которые были достигнуты, на первое место я бы поставил работу, посвященную устройству прокоагулянтных тромбоцитов, по которой в прошлом году у нас вышла публикация в Journal of Biological Chemistry.

Дело в том, что тромбоциты при активации делятся на несколько субпопуляций с радикально различающимися свойствами. И ученые очень долго спорили о существовании этих субпопуляций, о том, в каких ситуациях они образуются.

 

Кроветворные стволовые клеткиБиолог Джеральд де Хаан об образовании крови, трансплантации костного мозга и лечении гемофилии

Изначально эти субпопуляции обнаруживали благодаря тому, что тромбоциты, входящие в открытую субпопуляцию, были покрыты слоем белков. В английском языке использовался термин coat — «шуба». И сами эти тромбоциты на русском языке называют «укутанными». Субпопуляция таких тромбоцитов отличалась тем, что, с одной стороны, они были скорее мертвыми, в них прекратились процессы метаболизма, с другой стороны, на их поверхности была плотная шуба из белков, которые секретировали тромбоциты.

Вплоть до самого последнего момента было совершенно неясно, зачем эти мертвые тромбоциты нужны. На их поверхности нет нормальных рецепторов для агрегации. Они могут очень сильно ускорять мембранные реакции свертывания, но зачем это нужно, если они не могут встроиться в агрегат нормальных тромбоцитов?

Мы это активно исследовали начиная с 2004 года. И та работа, которая у нас вышла в сотрудничестве с французскими учеными, в значительной степени перевернула эту область.

Это был цикл из двух работ. Первая работа, которая в основном делалась Аленой Якименко, показала, что у этих тромбоцитов уникальный механизм агрегации. Он отличается от того, что знали о них раньше. Эти тромбоциты не могут агрегировать между собой, но могут прикрепляться к обычным тромбоцитам. Это что-то вроде защитного механизма. Сами по себе они не допускают формирования тромбов и агрегатов.

Второй момент, который мы открыли в последней работе, — что все белки, формирующие эту шубу, находятся в одной небольшой области на поверхности тромбоцита — яркой выпуклой точке, которую мы, естественно, назвали шапкой. Это было сделано с помощью конфокального микроскопа. Только он позволил достаточно детально изучить структуру тромбоцита, чтобы это обнаружить.

И скорее всего, именно через эту шапку, всего через одну точку на своей поверхности, эти тромбоциты могут встраиваться в тромбы.

Это позволяет пересмотреть то, как вообще формируются тромбы, потому что роль этих тромбоцитов в формировании тромбов была загадочной. С одной стороны, по клиническим данным она очень важна. А с другой стороны, что они делают и зачем — непонятно. И это позволило нам высказать гипотезы, которые мы сейчас активно проверяем. Похоже, что эти тромбоциты действительно играют решающую роль, совсем не такую, как можно было бы предположить. И именно для этой роли нужно их такое хитрое встраивание в тромб.

О модульном анализе системы свертывания крови

Второй пример того, что было получено в нашей команде по итогам как минимум десяти лет исследований, — это модульный анализ системы свертывания крови. В этом результате есть две составляющие. Во-первых, мы разработали методологию работы с такими системами. Методологию, которую можно применять к самым разным сложным биологическим системам.

И во-вторых, мы ее успешно применили к свертыванию крови. Для этой системы, наверное, первой из подобных систем у млекопитающих, мы сумели провести детальный модульный анализ. Нам удалось разобрать ее на блоки, поняв, какой блок за что отвечает: один блок отвечает за пороговость ответа системы, за то, что система работает в режиме «все или ничего»; другой блок обеспечивает распространение системы в пространстве, чтобы она быстро, эффективно перекрывала всю рану и делала это максимально надежно; еще один блок тормозит эту систему, то есть выключает распространение, когда процесс доходит до здоровой ткани; дополнительный блок регулирует зависимость от потока, это отдельная биохимия, которую вообще нельзя понять, если не принимать во внимание, что это происходит в присутствии потока крови, это блок реакций, который включается в потоке.

Помимо того, что благодаря этому методу можно понимать разные системы, есть два направления, которые за этим немедленно следуют, — диагностика и терапия. При диагностике, видя какие-то нарушения, мы можем предположить, что их вызвало. И наоборот, если у нас есть молекулярные представления о том, какие у человека нарушения, мы можем воздействовать целенаправленно. Лекарственные препараты воздействуют на разные стадии процесса свертывания, на разные блоки в этой сложной сети. И если мы будем полностью понимать, как она работает, мы сможем делать избирательные препараты, которые будут корректировать нарушение, но не перекашивать систему в другую сторону.

Сейчас практически все препараты, которые используются для лечения тромбоза, влияют и на гемостаз. То есть человек пьет препараты, которые подавляют формирование тромбов, и у него, как правило, нарушается нормальное свертывание и возникает риск кровотечений.

А если человек использует препараты, которые улучшают свертывание, у него повышается риск тромбозов. И нельзя эту систему просто так исправить. Можно только грубо ее толкнуть в ту или иную сторону. Естественно, что дальше врач вынужден думать, чем ему рисковать: кровоизлиянием в мозг или тромбозом в легочной артерии.

О приборе для теста «Тромбодинамика»

На протяжении последних 15 лет параллельно с теоретической разработкой мы занимались внедрением модульного анализа в практику. Несколько лет назад при поддержке «Роснано» нашему коллективу под руководством Фазли это удалось. Мы создали компанию «ГемаКор», которая уже под популярным названием «Тромбодинамика» сейчас производит и поддерживает метод, направленный на диагностику нарушений свертывания крови. В этом методе мы используем нанопокрытие белка тканевого фактора, который запускает процесс свертывания. Принципиальная идея этого метода в разнесении в пространстве различных фаз: фазы запуска, роста и остановки роста фибринового сгустка, — то, что обычные тесты делать не позволяют.

Наш метод обладает высокой чувствительностью, он позволяет проследить влияние разных лекарственных препаратов на отдельные фазы процессов свертывания. Три года назад к нам обращалась компания «Аркемикс», занимающаяся разработкой лекарственных препаратов, чтобы с нашей помощью опробовать один из тестовых препаратов. По результатам у нас вышли две совместных статьи, которые показывали особенности работы этого препарата, как его можно или нельзя комбинировать с другими средствами.

В прошлом году созданный нами прибор для диагностики нарушения свертывания крови методом тромбодинамики уже поступил в открытую продажу и сейчас уже стоит в разных местах. Пока он не вышел на стадию самоокупаемости, так как «Роснано» вложило примерно полмиллиарда рублей в этот проект, и нужно продать много приборов, чтобы компенсировать эти расходы.

Тем не менее интерес к прибору в России и за рубежом очень большой. Он стоит в разных испытательных вариантах в Америке, Франции и еще в нескольких точках, с которыми мы ведем научное сотрудничество. Первые образцы уже продаются в Англии, Голландии и других странах. По России он сейчас стоит в ряде крупнейших лабораторий, занимающихся гемостазом или клиническими вопросами, которые могут немедленно вести к сложностям, к гемостазу. Например, в Институте Склифосовского и в других местах.

О методе исследования сложных систем

Сейчас к нашей деятельности по тромбодинамике присоединился фонд «Сколково», который поддержал дальнейшее развитие этого метода, чтобы он стал еще более чувствительным и включал в себя также и нарушения тромбоцитов. Собственно, с научной точки зрения этот метод разработан, он позволяет определить активность белка в пространстве и времени. Если тромбодинамика в каком-то смысле просто смотрела на светорассеяние, то, что можно видеть глазом, то активность белка — это то, что глазом не видно. Поэтому там используется флуорогенный субстрат — молекула, которая расщепляется активным ферментом, генерируется активная светящаяся метка, а потом с помощью так называемых математических методов работы с обратными задачами из распределения метки восстанавливается распределение фермента.

Это достаточно сложный и интересный метод, мы много лет добивались его принципиальной реализации. Сейчас у нас научный прибор, и одна из ближайших задач — превратить его в коммерческий, или, более строго, в клинический, чтобы с ним мог работать лаборант в обычной лаборатории, а врач мог бы интерпретировать результаты.

В фундаментальных исследованиях главное, с чем мы сражаемся, — это разработка метода исследования сложных систем. Потому что система свертывания крови в каком-то смысле хорошая система. Несмотря на всю ее сложность, в ней известны все белки, в ней известны почти все реакции. Для каждой реакции известна более или менее ее скорость.

Другие системы, например сигнальные системы внутри тромбоцитов, — это тысячи реакций, о сотнях из которых мы не имеем представления, и все это тоже динамические системы, работающие в пространстве и времени. Изучать их крайне сложно.

Наша главная фундаментальная задача в области гемостаза, как ни банально это звучит, — понять, как он работает. Потому что, несмотря на весь прогресс за последние годы, несмотря на то, что для одной части гемостаза, системы свертывания, мы смогли провести модульный анализ, мы до сих пор не знаем, как образуются тромбы. Например, никто сейчас не скажет, почему тромбы не растут до бесконечности, а вырастают только до определенного размера. У ученых, которые этим занимаются, сейчас есть 5–6 гипотез. Все сильно противоречат друг другу, и экспериментальные данные тоже противоречивы. Так что понимание принципов регуляции формирования тромбов, гемостатических сгустков и понимание того, как этим управлять, — это та главная цель, которая стоит перед нашей командой.

Фото: Евгений Вербовой / ПостНаука