Свечение светлячков вызывается химическим процессом биолюминесценции в их теле. Свет излучается, когда внутриклеточный кислород соединяется с кальцием, молекулой аденозинтрифосфата (АТФ), служащей хранилищем энергии, и пигментом люциферином в присутствии фермента лоюциферазы. В отличие от ламп накаливания, выделяющих большое количество тепла, светлячки испускают «холодный свет». Если бы их светорождающий орган нагревался до температуры колбы лампочки, насекомое погибло бы.

Для «включения» света орган, управляющий свечением, начинает подавать кислород к другим соединениям, необходимым для генерирования света, а для «выключения» прекращает подачу. Когда кислород есть, орган свечения испускает свет, а когда кислорода нет, гаснет.
Легких у насекомых нет, и кислород извне подается в организм по сложной системе постепенно сужающихся трубочек, которые называются трахеолами. 

Мышцы, управляющие подачей кислорода из трахеол, работают довольно медленно, и быстрое включение свечения долгое время оставалось загадкой.

Однако недавно ученые выяснили, что ключевую роль играет окись азота. Обычно весь кислород, необходимый органеллам для генерации энергии в клетках, удерживают митохондрии.
Чтобы заставить митохондрии отдать часть кислорода, мозг насекомого дает команду на выработку окиси азота, которая замещает кислород в митохондриях. Вытесняемый ею кислород поступает к органам свечения и может использоваться в химических реакциях, в результате которых испускается свет. Однако окись азота быстро разлагается, поэтому кислород вскоре вновь связывается и генерация света прекращается.

Зажигаются светлячки по разным причинам. Они вырабатывают в своих телах защитные стероиды, которые делают их неприятными на вкус для хищников, а их свечение служит сигналом, предупреждающим об их несъедобности.
Взрослые особи многих видов мерцают определенным образом, специфичным для каждого из них, что позволяет их половым партнерам отличать их от других.
Исследования показали, что самки выбирают самцов по характеристикам их мерцания.
Выяснилось, что у двух видов светлячков самки предпочитают самцов с более ярким свечением и более высокой частотой мерцания.