25.04.02. Оптическая микроскопия с разрешением порядка 30 нм
Существование дифракционного предела ограничивает возможности оптической микроскопии (и не только). Для повышения разрешения необходимо либо переходить к меньшим длинам волн, либо каким-либо образом "выкручиваться". В недавней работе ученых из Геттингена сообщается о достижении разрешения порядка 30 нм при использовании света с длиной волны 760 нм (подчеркнем, что речь идет не о ближнепольной микроскопии).
Рис.1. a - схема STED-4Pi микроскопа, возбуждение (Exc.) и регистрация сигнала происходят через линзу L1; b - схема энергетических уровней молекулы красителя.
Давно известно, что невозможно сфокусировать свет в пятно с диаметром менее половины длины волны. Это фундаментальное ограничение "мешает" не только ученым. Оно заставляет производителей микросхем переходить к работе с более коротковолновым излучением (недавно мы писали об успешных опытах по фотолитографии с использованием дальнего ультрафиолета ). Естественно, переход к новому диапазону связан со сменой используемых оптических элементов и источников излучения, что применительно к промышленности приводит к необходимости грандиозных капиталовложений.
Ученые, конечно, давно уже не ограничивают свой исследовательский инструментарий видимым диапазоном электромагнитных волн - рентгеновская микроскопия, голография в рентгеновском и гамма-диапазоне , электронная микроскопия и т.д. позволяют получать изображения объектов с нанометровым и атомным разрешением. Однако не всегда удобно работать с коротковолновым излучением, например, оно не позволяет проводить неповреждающее исследование биологических объектов (микроорганизмы, клетки).
В принципе, существует способ получить разрешение порядка десятка нанометров, работая со светом видимого диапазона, - речь идет о ближнепольной микроскопии. По своему исполнению оптический ближнепольный микроскоп напоминает сканирующий туннельный микроскоп, только в качестве зонда используется заостренное оптоволокно, покрытое с боков металлической пленкой. Диаметр выходного отверстия может быть много меньше длины волны, а сам зонд располагается в непосредственной близости от поверхности исследуемого образца, что обеспечивает локальное возбуждение образца, когда размер светового пятна на поверхности много меньше длины волны. В волокно заводится лазерное излучение, а сигнал регистрируется либо с помощью обычной оптики, либо через это же волокно. Из сказанного очевидно, что, при всех своих достоинствах, ближнепольная микроскопия также не является удобным инструментом исследования живых биологических объектов, для которых практически невозможно точно контролировать расстояние между зондом и поверхностью объекта.
Попытки преодолеть дифракционный предел в обычной ("дальнепольной" - для свободно распространяющихся электромагнитных волн) микроскопии предпринимаются уже давно. В 4Pi- микроскопии за счет когерентного сложения двух оптических фронтов удается повысить разрешение (в одном измерении) до 100 нм, однако эта методика все же остается дифракционно-ограниченной. Преодолеть дифракционный предел позволяет одна из разновидностей люминесцентной микроскопии - STED-микроскопия (STimulated Emission Depletion microscopy). В этой методике происходит подавление спонтанного излучения на периферии пятна люминесценции, полученного с помощью сканирующего конфокального микроскопа, за счет вынужденного излучения. Немецким исследователям за счет совмещения двух этих методик удалось достичь разрешения порядка 30 нм при использовании излучения с длиной волны 760 нм [1].
Рис.2. Изображение bacillus megaterium, полученное с помощью: a - конфокальной микроскопии; b, c - STED-4Pi микроскопии (с - после обработки изображения).
На рис.1 показана схема созданного учеными из Геттингена STED-4Pi микроскопа. Сначала образец (в экспериментах использовались красители RH414 и Pyridine 2), расположенный в фокальной плоскости линз L1 и L2, возбуждается с помощью 250-фемтосекундного лазера (Exc. на рисунке) с длиной волны 554 нм. Непосредственно вслед за фемтосекундным импульсом приходил 13- пикосекундный импульс (STED на рисунке) с длиной волны 760 нм. Под действием фотонов с такой энергией происходило вынужденое излучение, при этом молекулы из возбужденного состояния S1 переходили на колебательные подуровни основного состояния Svib 0 с последующей релаксацией (с субпикосекундными временами) на уровень S0 (см. вставку b на рис.1), что препятствовало переходу в возбужденное состояние в дальнейшем, так как энергии кванта пикосекундного лазера для этого недостаточно. В результате по окончании пикосекундного импульса люминесценция наблюдалась только с небольшого участка первоначального пятна возбуждения, имеющего форму "полоски" с толщиной порядка 30 - 40 нм. Таким образом, было достигнуто наилучшее на сегодняшний момент для "обычной" оптической микроскопии разрешение - l /23.
На рис.2 показано изображение bacillus megaterium, мембрана которой была помечена молекулами красител RH414, полученное с помощью конфокальной оптической микроскопии (a) и STED-4Pi-микроскопии (b,c), в последнем случае разрешение вдоль оси X составляло порядка 30 - 40 нм. Как говорится, почувствуйте разницу!
