Исследователи из Университета Коннектикута (University of Connecticut UConn, США) секвенировали РНК самого сложного гена в природе, используя ручной секвенатор размером c мобильный телефон.
Специалист по геномике Брентон Гревели (Brenton Graveley) из Института Системной Геномики (Institute of Systems Genomics) Университета Коннектикута, научный сотрудник Моан Болисетти (Mohan Bolisetty) и выпускник Гопинат Раджадинакаран (Gopinath Rajadinakaran) объединились с компанией Oxford Nanopore Technologies (Великобритания), чтобы продемонстрировать, что нанопоровый секвенатор MinION способен секвенировать гены быстрее, точнее и дешевле по сравнению со стандартным методом. Результаты исследования опубликованы в журнале Genome Biology.
Исследователи нередко хотят знать, какая именно версия гена экспрессируется в организме, но для сложных генов, для которых существует множество вариантов транскриптов, узнать это путем обычного секвенирования невозможно.
Гревели, Болисетти и Раджадинакаран решили эту задачу. Сначала необходимо было выбрать подходящий метод секвенирования. При секвенирования существующими методами исследователи обычно получают множество копий гена, затем эти копии разрезают на мелкие кусочки, считывают каждый из них и, сравнивая различные фрагменты, пытаются понять, как исходно они располагались, то есть собирают их в единую последовательность.
Однако этот метод не сработает для генов с множеством транскриптов, поскольку, каждая копия может немного или сильно отличаться от другой. Такие различающиеся варианты одного гена называются изоформами. Когда различные изоформы режутся и секвенируются, сравнение фрагментов и сборка последовательности становятся невозможными.
Однако в прошлом году почти невозможное внезапно стало возможным. Компания Oxford Nanopore выпустила новый нанопоровый секвенатор и предложила один из экземпляров лаборатории Гревели. Секвенатор Oxford Nanopore работает, пропуская однонитевую ДНК сквозь крошечную пору. Эта пора способна удерживать только пять азотистых оснований ДНК одновременно. Имея всего 4 основания – А, G, Т и C – можно получить 1024 возможных пятибуквенных комбинаций. Каждая комбинация создает различный электрический поток в нанопоре: поток, создаваемый последовательностью GGGGА отличается от такового у последовательности АGGGG и CGGGG. Пропуская нить ДНК через пору и записывая итоговый сигнал, исследователи могут считывать последовательность ДНК.
Для секвенирования исследователи выбрали сложный ген, называемый геном молекулы клеточной адгезии синдрома Дауна Dscam1 (Down Syndrome cell adhesion molecule 1), контролирующий схему нейронных соединений в головном мозге дрозофилы. Dscam1 потенциально способен давать 38 016 изоформ, и каждая мушка способна "синтезировать" каждый из них, хотя сколько версий этого гена действительно создается – остается неизвестным.
Dscam1 похож на последовательность вида X-12-X-48-X-33-X-2-X, где X обозначает участки, которые всегда имеют одинаковую последовательность, а числа указывают на варьирующие части (само число показывает количество различных опций, возможных в этом участке).
Для выяснения числа действительно существующих в головном мозге плодовой мушки изоформ Dscam1 исследователи сначала конвертировали последовательности РНК гена в ДНК. В молекуле ДНК закодирована последовательность всех 38 016 изоформ гена Dscam1, в то время как отдельная РНК Dscam1 является инструкцией только одного гена. До сих пор еще никто не использовал MinION для секвенирования копий РНК и, хотя было весьма вероятно, что это можно сделать, демонстрация того, насколько хорошо метод работает, может стать существенным продвижением в области секвенирования.
Раджадинакаран выделил РНК из головного мозга дрозофилы, конвертировал ее в ДНК, выделил копии ДНК гена Dscam1 и прочел их на секвенаторе MinION. В этом единственном эксперименте исследователи обнаружили не только экспрессию 7899 изоформ из возможных 38016, но и то, что, видимо, может экспрессироваться гораздо больше версий гена, если не все.
"Многие говорили, что MinION не будет работать, но мы показали его работоспособность, используя наиболее сложный из известных генов", – говорит Гравели.
Исследование демонстрирует, что технология секвенирования генов теперь может быть доступна более широкому кругу исследователей, чем раньше, поскольку MinION является относительно недорогим и портативным устройством и поэтому почти не занимает места в лаборатории.
Далее ученые планируют взяться за большее: секвенировать каждый фрагмент РНК отдельной клетки от начала до конца, что невозможно сделать традиционным способом секвенирования.
"Эта технология обладает впечатляющим потенциалом трансформации исследования биологии РНК и получаемой информации, – говори Гревели, – Плюс тот факт, что MinION является ручным секвенатором, который можно подключить к ноутбуку – просто невероятно замечателен!".
http://cbio.ru/page/43/id/5813/
