Главными героями игры являются итальянский водопроводчик Марио и его брат Луиджи (англ. Luigi) (в качестве второго игрока). Их цель — пробраться через Грибное Королевство, ускользая или уничтожая солдат Короля Куупы (также известным, как Bowser) и спасти Принцессу.

Марио атакует противников, прыгая на них сверху. Такой способ убивает грибов-предателей Гумба (англ. Goomba) и временно нейтрализует черепах Куупа (англ. Koopa Troopas), заставляя их прятаться в свои панцири. Также Марио может пинать «испугавшихся» черепах в других врагов. Катящаяся черепаха сметает всех на своем пути, но, если встретить на своем пути преграду, изменит направление и может попасть в самого Марио. Некоторых врагов, например дикобразов Спини (англ. Spiny), убить можно только выстрелив огненным шаром или пнув в них черепаху. Если же Марио просто запрыгнет на них, то это поранит только его.

По пути Марио собирает монеты и бонусы, ударяя по блокам, с нарисованным знаком вопроса. За врагов Марио получает очки. Получив гриб-бонус, игрок превращается в Супер Марио, а если взять после этого цветок-бонус, то Супер Марио становится Огненным Марио (англ. Fiery Mario), который может стрелять огненными шарами. Если Супер Марио или Огненный Марио дотрагиваются до противника, то они превращаются обратно в Марио. Если же противник ранит Марио или кончается время, данное на прохождение уровня, то игрок теряет одну жизнь и игра начинается заново (с последнего чекпоинта). В уровнях, которые расположены в замках, нет чекпоинтов и погибший Марио начинает игру всегда с начала уровня. Еще один бонус — звезда. Заполучив ее, Марио становится на некоторое время бессмертен. Противники погибают от одного его прикосновения, но Марио все равно погибнет, если кончится время, или он упадет в лаву или пропасть.

Игра состоит из восьми миров по четыре уровня в каждом. В первом уровне во всех мирах Марио находится на земле, во втором — чаще всего под землей в канализации или под водой, в третьем уровне Марио прыгает по платформам, висящим в воздухе, в четвертом уровне Марио попадает в замок. Во всех мирах, кроме третьего и шестого, Марио путешествует днем. В конце каждого четвертого уровня, на мосту через озеро с лавой, Марио борется с Королем Куупой (англ. King Koopa) — гигантской черепахой с шипами. Король Куупа дышит огнем, а, начиная с шестого мира,— еще и метает огромные молоты. Победить Короля Куупу можно двумя способами. Если Марио нажмет на топор, который находится по другую сторону моста, тогда мост откроется и Король Купа упадет в лаву. Для Короля Купы также смертельны огненные шары Огненного Марио. В случае победы над Купой в первых семи мирах с помощью огня, выясняется, что это на самом деле переодетый простой враг, как черепаха, гумба и т. д. После этого, Марио встречает Тоада (англ. Toad) — жителя Грибного Королевства, который говорит ему знаменитую фразу: «Thank you Mario, but our princess is in another castle!» (Спасибо, Марио, но наша принцесса в другом замке!).

После того, как игрок пройдет всю игру полностью, он получит возможность начать игру в более сложном режиме (Hard Mode), в котором враги передвигаются быстрее, некоторые противники заменяются на более сложных: например, грибы Гумба заменяются на черепах, черепахи — на броненосцев и т. д.